Bacillus sp. SMIA-2 cresceu e secretou proteases quando cultivado em culturas líquidas contendo citrato trissódico como fonte de carbono e nitrato de amônio como fonte de nitrogênio. A atividade máxima da enzima foi alcançada após 8 horas de incubação do microrganismo, com níveis de 7,2 U.mg -1 proteína. A suplementação do meio com 2,0 mM de CaCl2 não proporcionou um aumento da atividade da protease, porém aumentou a sua estabilidade de 2 para 4 horas. A redução da concentração do fosfato de potássio no meio de cultura de 11,0 para 5,0 mM promoveu um acréscimo de 82% (13 U.mg -1 proteína) na atividade da protease. A substituição do nitrato de amônio presente no meio de cultura por 0,1% de soro de queijo aumentou a atividade da protease para 25 U.mg -1 proteína. Nestas condições, o tempo requerido para que a enzima atingisse seu pico de atividade máxima, que antes era de 9 horas, passou para 16 horas. A substituição do citrato trissódico do meio de cultura pela água de maceração de milho (0,5%) não só aumentou a atividade da enzima como também retardou o processo de desativação que é típico da produção de proteases. A atividade máxima da enzima obtida quando estes dois resíduos foram utilizados no meio foi 59,5 U.mg -1 proteína. Após alcançar este valor a enzima se manteve estável por mais de 20 horas o que favorece a sua produção em larga escala.

Bacillus sp. SMIA-2 grew and produced proteases when cultivated in liquid cultures containing trisodium citrate as a carbon source and ammonium nitrate as a nitrogen source. The maximum activity of the enzyme was reached after incubating the microorganism for 9 hours, with levels of 7.2 U.mg -1 protein. The supplementation of the medium with 2.0 mM of CaCl2 did not improve the activity of the protease, but increased its stability from 2 to 4 hours. The reduction in the amount of inorganic phosphate in the medium from 11.0 to 5.0 mM resulted in an improvement of 82% (13 U.mg -1 protein) in the protease activity. Replacing ammonium nitrate in the medium by 0.1% milk whey increased the protease activity to 25 U.mg -1 protein. In these conditions, the time required for the enzyme to reach a maximum activity increased from 9 to 16 hours. Replacing citrate trissodium in the medium by corn steep liquor (0.5%) not only produced much better enzyme activity, but also delayed the deactivation process which is typical for the production of proteases. The maximum activity reached when these wastes were used in the medium was 59.5 U.mg -1 protein. In addition, the enzyme maintained stable for more than 20 hours, which is favorable for its production on a large scale.

As enzimas, principalmente as proteases, têm uma participação importante e indispensável em muitos processos industriais tais como na indústria farmacêutica, de alimentos e de detergentes. Alguns detergentes como Tide®, Ariel® e Biz® contem enzimas proteolíticas em sua formulação, sendo a maioria produzida por bactérias do gênero Bacillus sp. Neste artigo, foi avaliada a compatibilidade de uma protease produzida por um microrganismo termofílico, Bacillus sp., com alguns detergentes comerciais. Estudos sobre a estabilidade mostraram que a enzima reteve cerca de 95% e 74% de sua máxima atividade após 1h a 60ºC na presença de glicina em combinação com MnSO4 e CaCl2 respectivamente. A enzima não foi inibida em presença de 1.0 - 5.0 mM de EDTA. A adição de Triton X-100 inibiu a atividade enzimática em todas as concentrações estudadas. A enzima não foi estável na presença de uma solução a 5% (v/v) de peróxido de hidrogênio. A protease manteve mais de 80% e 65% de atividade após 30 min de incubação na presença dos detergentes Tide® e Cheer® respectivamente. Após adição de CaCl2 (10 mM) e glicina (1 mM), a enzima manteve mais de 85% de atividade após 1 hora de incubação em presença do detergente Tide®. Considerando estas propriedades, a protease de Bacillus sp., pode ser útil na indústria de detergentes.

Enzymes, and particularly proteases, have become an important and indispensable part of industrial processes such as laundry detergents, pharmaceuticals and food products. Detergents such as Tide®, Ariel® and Biz® contain proteolytic enzymes, most of them produced by members of the genus Bacillus. This paper describes the compatibility of protease produced by the thermophilic Bacillus sp, with commercial laundry detergent. Stability studies indicated that this enzyme retained about 95% and 74% of its maximum activity after 1h at 60ºC in the presence of glycine in combination with MnSO4 and CaCl2, respectively. No inhibitory effect was observed at 1.0-5.0 mM of EDTA. Triton X-100 inhibited the enzyme in all the concentrations tested. The enzyme was unstable in a 5% (v/v) concentration of peroxide solution. The protease retained more than 80% and 65% of its activity after 30 min incubation at 60ºC in the presence of Tide® and Cheer® detergents, respectively. After supplementation of CaCl2 (10 mM) and glycine (1 mM), the enzyme in Tide® detergent retained more than 85% of its activity after 1h. Based on these findings, Bacillus sp. protease shows a good potential for application in laundry detergents.

A produção de proteases por Bacillus sp. SMIA-2 cultivado em um meio de cultura contendo soro de leite e água de maceração de milho foi estudada. Além disso, a compatibilidade da enzima com detergentes comerciais foi também avaliada. A atividade máxima da enzima (70 U/mg proteína) foi observada na fase estacionária de crescimento, com 32 h de incubação. Estudos sobre a caracterização da protease revelaram que a temperatura ótima para atividade desta enzima foi 70 °C e que a mesma manteve 91% de sua atividade quando incubada a 70 °C na presença do cálcio. O valor ótimo de pH encontrado para a protease foi 8,0, sendo que a enzima manteve 85% e 46% de sua atividade quando incubada por 1 h em pH 9 e pH 10 respectivamente. A protease manteve 64% e 50% de sua atividade quando incubada a 70 °C por 30 min com os detergentes Cheer® e Tide® respectivamente. A utilização da glicina juntamente com íons cálcio resultou em um aumento da estabilidade enzimática em todos os detergentes testados. Em presença dos detergentes Ultra bizz®, Cheer® e Tide®, a enzima manteve aproximadamente 100% de atividade, após 30 min de incubação a 70 °C.

The production of protease by the thermophilic Bacillus sp. SMIA-2 cultivated in a medium containing whey and corn steep liquor was studied. In addition, the compatibility of the enzyme with commercial detergents was evaluated. The maximum activity of the enzyme (70 U/mg protein) was observed in the phase stationary of growth, with 32 h of incubation. Studies on the protease characterization revealed that the optimum temperature of this enzyme was 70 °C and that it maintained 91% of its activity when incubated a 70 °C in the presence of calcium. The optimum pH of the enzyme was found to be 8.0 and the enzyme maintained 85% and 46% of its original activity when incubated for 1 h at pH 9 and pH 10 respectively. Protease retained 64% and 50% of its activity after 30 min incubation at 70 °C in presence of the detergents Cheer® and Tide® respectively. The addition of glycine and calcium improved the stability of the enzyme in all detergents used. In the presence of the detergents Ultra bizz®, Cheer® and Tide®, the enzyme maintained 100% of its activity after 30 min of incubation at 70 °C.

A produção de protease pelo termofílico Bacillus sp cepa SMIA-2 cultivado em culturas líquidas contendo citrato trissódico alcançou o máximo em 9h, com níveis de 1,93U/mg de proteína. O microrganismo utilizou várias fontes de carbono para a produção da protease, sendo que o amido foi o melhor substrato seguido por citrato trissódico, ácido cítrico e sacarose. Entre as várias fontes de nitrogênio orgânico e inorgânico, o nitrato de amônio foi a melhor. Estudos sobre a caracterização da protease revelaram que a temperatura ótima desta enzima foi 60ºC. A enzima foi estável por 2h a 30ºC, enquanto a 40ºC and 80ºC, 14% e 84% da atividade original foram perdidas, respectivamente. O valor ótimo de pH encontrado para a enzima foi 8,0. Após a incubação da solução enzimática bruta por 24h a pH 5,5, 8,0, e 9,0 foi observado um decréscimo de em torno de 51%, 18% e 66% da sua atividade original, respectivamente. Um forte efeito inibitório foi observado na presença de K+, Hg2+, Cu2+. A presença de Hg+ resultou na perda completa da atividade da enzima na concentração de 1mM. A atividade foi estimulada pela presença do Mn2+ e Ca+2, indicando que estes íons tiveram um papel funcional na estrutura molecular da enzima.

Protease production by thermophilic Bacillus sp strain SMIA-2 cultivated in liquid cultures containing trisodium citrate reached a maximum in 9h, with levels of 1.93U/mg protein. The microorganism utilized several carbon sources for the production of protease. Starch was the best substrate, followed by trisodium citrate, citric acid and sucrose. Among the various organic and inorganic nitrogen sources, ammonium nitrate was found to be the best. Studies on the protease characterization revealed that the optimum temperature of this enzyme was 60ºC. The enzyme was stable for 2h at 30ºC, while at 40ºC and 80ºC, 14% and 84% of the original activities were lost, respectively. The optimum pH of the enzyme was found to be 8.0. After incubation of crude enzyme solution for 24h at pH 5.5, 8.0 and 9.0, a decrease of about 51%, 18% and 66% of its original activity was observed respectively. A stronger inhibitory effect was observed in the presence of K+, Hg2+and Cu2+. Hg+ resulted in the complete loss of activity at 1mM concentrations. Activity was stimulated by Mn2+ and Ca+2, indicating that these ions had a functional role in the molecular structure of the enzyme.